بسم الله الرحمن الرحيم
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده
پايان نامه (يا رساله)براي دريافت درجه کارشناسي ارشد در رشته زيست سلولي و مولکولي گرايش بيوتکنولوژي ميکروبي
عنوان
جداسازي و شناسايي مولکولي باکتريهاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز از نمونه هاي محيطي
استاد راهنما
دکتر حميد رضا پردلي
نگارنده
آيلين مهامي
شهريور 1393
يرفع الله الذي آمنوا منکم و الذين اوتوالعلم درجات قرآن کريم
كارشناسي ارشد خانم آيلين مهامي
با عنوان جداسازي و شناسايي مولکولي باکتريهاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز از نمونه هاي محيطي
در جلسه مورخ 17/6/1393 تحت نظارت شوراي پايان نامه متشكل از استادان زير با درجه …………………………….. و نمره ……………………….. مورد تأييد قرار گرفت.
1- استاد ( استادان) راهنما : نام و نام خانوادگي حميدرضا پر دلي امضاء
2- داور داخل گروه : نام و نام خانوادگي نازيلا ارباب سليماني امضاء
3- داور خارج از گروه : نام و نام خانوادگي بهاره کاشفي امضاء
دكتر شهرام رضوان بيدختي
معاون پژوهشي دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
سپاسگذاري
خداوند بزرگ و مهربان را شاکرم که با لطف و عنايت بي کرانش توانستم پايان نامه تحصيلي خود را به اتمام برسانم، بر خود لازم مي دانم از کليه سروراني که پيوسته ياريم نمودند تشکر و قدرداني نمايم.
از پدر و مادر عزيزم که هر آنچه دارم مرهون زحمات ايشان مي باشد،نهايت سپاسگذاري را دارم.
از زحمات وراهنمايي هاي خالصانه،هميشگي و دلسوزانه استاد عزيز و بزرگوارم جناب آقاي دکتر حميد رضا پردلي که در تمام مراحل پايان نامه همراه من بوده و پيوسته من را از راهنمايي هاي ارزنده خود بهرمند کردند،کمال تشکر را دارم.
همچنين از داوران محترم سرکار خانم دکتر ارباب سليماني و سرکار خانم دکتر کاشفي که زحمت بازخواني اين پايان نامه را متقبل شدند،قدرداني مي نماييم.
باشد که اين خرد ترين،بخشي از زحمات آنان را سپاس گويد.
فهرست مطالب
عنوان صفحه چکيده1
فصل اول-کليات……………………………………………………………………………………………………………..29_2
1 مقدمه3
1-1 پرسش اصلي تحقيق4
1-2 فرضيه ها4
1-3 اهداف تحقيق4
1-4 فروکتوزيل ترانسفرازميکروبي4
1-5 فروکتان ها5
1-6 بيوسنتز فروکتام ميکروبي8
1-7 ساختار فروکتوزيل ترانسفراز11
1-8 سازماندهي ژني فروکتوزيل ترانسفراز ها16
1-9 بيان ژني فروکتوزيل ترانسفراز ميکروبي20
1-10نقش بيولوژيکي فروکتوزيل ترانسفراز و فروکتان ها24
1-11 پيشرفتهاي اخير در تحقيقات بر روي فروکتان ها 27
فصل دوم : مروري بر تحقيقات انجام شده در ايران و خارج از ايران……………………………………..34 _29
1-1 تحقيقات انجام شده در ايران30
1-2 تحقيقات انجام شده در خارج از ايران30
فصل سوم: مواد و روشها………………………………………………………………………………………………..51_35
3-1 نمونه گيري و استريل کردن نمونه ها26
3-2 سنجش آنزيم37
3-3 بررسي مولکولي47
3-3-1 استخراج DNA از ايزوله47
3-3-2 آناليز کيفي و کمي DNA استخراجي48
3-3-3 طريقه ساخت بافر48
3-3-4 الکتروفورز48
3-3-5 آناليز کمي49
3-3-6 واکنش PCR49
3-3-6-1اجزاي واکنش srDNA-PCR1649
3-3-7 آناليز کيفي محصولات PCR……….50
فصل چهارم : نتايج ……………………………………………………………………………………………………. …69 _51
4-1 جداسازي باکتري هاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز52
4-2 شناسايي فنوتيپي باکتري هاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز52
4-3 نتايج استخراج DNA ژنومي58
4-4 نتايج واکنش srDAN-PCR1659
4-5 رديف سازي توالي بدست آمده در بانک ژن59
4-6 رديف سازي توالي بدست آمده در بانک ژن به منظور تعيين گونه باکتري59
فصل پنجم-بحث و نتيجه گيري………………………………………………………………………………………74_69
5-1 نتيجه گيري 73
5-2 جمع بندي73
5-3 پيشنهادات74
منابع75
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-1 بررسي ويژگي هاي جنبشي آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز10
جدول 3-1 جذب پس از 6 ساعت 40
جدول 3-2 جذب پس از 12 ساعت41
جدول 3-3 جذب پس از 24 ساعت42
جدول 3-4 ميزان گلوکز پس از 6 ساعت44
جدول 3-5 ميزان گلوکز پس از 12 ساعت45
جدول 3-6 ميزان گلوکز پس از 24 ساعت46
جدول 3-7 اجزاي واکنش . srDNA-PCR1649
جدول 3-8 پرايمر ها و اندازه قطعه تکثيري50
جدول 3-9 برنامه هاي دمايي ترموسايکر50
جدول 4-1 شکل ميکروسکوپي نمونه ها53
جدول 4-2 نتايج تست هاس افتراقي54
جدول 4-3 باکتري هاي موجود در نمونه ها 56
جدول 4-4 نتايج در سطح جنس و گونه68
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 1-1 طبقه بندي انواع فروکتان ها بر اساس نوع اتصال زنجيره ?-D فروکتوزيل با سوکروز7
شکل 1-2 توزيع آنزيم فروکتوزيل ترانسفرازدر 7 گروه از نظر فيلوژنتيک16
شکل 1-3 ساختار ژنهاي آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز در باکتريها مولد20
شکل 1-4 تنظيم بيان ژن فروکتوزيل ترانسفراز در برخي باکتري هاي مولد23
شکل 3-1 رشد کلني پس از 24 ساعت37
شکل 3-2 ايجاد کدورت پس از 6 ساعت اوليه38
شکل 3-3 پايداري رنگ تست گلوگز در 6،12،24 ساعت اوليه 43
شکل 3-4 دستگاه الکتروفورز49
شکل 3-5 دستگاه ترموسايکلر50
شکل 4-1 شکل ميکروسکوپي کلني پس از رنگ آميزي52
شکل 4-2 نتيجه استخراج DNA ژنومي 58
شکل 4-3 محصول تکثير PCR 59
شکل 4-4 پرايمر ريورس نمونه خاک عميق60
شکل 4-5 پرايمر ريورس نمونه پرتقال 61
شکل 4-6 پرايمر ريورس نمونه پرتفال 62
شکل 4-7 پرايمر ريورس نمونه سبوس63
شکل 4-8 رديف همترازي سازي نمونه خاک عميق64
شکل 4-9 رديف همترازي سازي نمونه پرتقال65
شکل 4-10 رديف همترازي سازي نمونه پرتقال مثبت66
شکل 4-11 رديف همترازي سازي نمونه سبوس67
فهرست نمودار ها
عنوان صفحه
نمودار 4-1 ميزان توليد گلوکز در 6 ساعت57
نمودار 4-2 ميزان توليد گلوکز در 12 ساعت57
نمودار 4-3 ميزان توليد گلوکز در 24 ساعت 58
چکيده فارسي
فروکتوزيل ترانسفراز هاي ميکروبي، پلي مرهايي هستند که در بيوسنتز فروکتان ميکروبي (لوان، اينولين، و اوليگوساکاريد-قندميوه اي) ، نقش دارند واز نظر ساختاري، فروکتوزيل ترانسفراز ميکروبي، دامنه ي کاتاليزوري خانواده ي گليکوزيد هيدروليز 68 را به اشتراک مي گذارند و در هفت گروه که از نظر فيلوژنتيک به هم مربوط مي شوند، گروه بندي مي گردند. فروکتوزيل ترانسفراز هاي ميکروبي از باکتريهاي گرم مثبت- گرم منفي و قارچ ها جدا شده اند. فروکتوزيل ترانسفراز داراي وزن مولکولي 480 کيلو دالتون مي باشد. بروز ژن فروکتوزيل ترانسفراز ، عمدتا توسط سيستم هاي دوجزئي يا مکانيزم هاي فسفريلاسيون تنظيم مي شوند که به دسترسي سوکرز يا ساير سيگنال هاي محيطي پاسخ مي دهند. فروکتان هاي ميکروبي، در ايجاد مقاومت در مقابل فشار محيطي مانند بي آبي، جذب مواد غذايي، تشکيل بيوفيلم و عوامل ويرولانس، نقش دارند.فروکتوزيل ترانسفراز سبب تسريع انتقال واحد فروکتوزيل به تعدادي از پذيرنده هاي مختلف مانند آب در واکنش هيدروليز سوکروز، گلوکز در واکنش تبادل، سوکروز يا فروکتان در پلي مريزاسيون استفاده مي کند .هدف از انجام اين تحقيق جداسازي و شناسايي مولکولي باکتري هاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز از نمونه هاي محيطي بوده است. به اين منظور براي بررسي باکتري هاي مولد آنزيم فوکوزيل ترانسفراز(لوان سوکراز) از منابع محيطي نظير پوست پرتقال، ضايعات ليمو، ضايعات موز، سبوس گندم و خاک استفاده شد. پس از تهيه سوسپانسيون و ته نشيني ذرات سوپرناتانت حاصل روي محيط هاي کشت NA و MC کشت داده شد. پليت ها به مدت 48 تا 72 ساعت در دماي 30 درجه انکوبه و سپس کلني هاي حاصل با روش هاي متداول و استاندارد باکتري شناسي شناسايي و تعيين هويت گرديدند.سنجش آنزيم فوکوزيل ترانسفراز(لوان سوکراز) براساس متد Yanase و همکاران(1992) مورد سنجش و ارزيابي قرار گرفته و غلظت گلوکز آزاد شده با فعاليت آنزيمي توسط کيت گلوکز ارزيابي شد. پس از شناسايي باکتري هاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز با روش بيوشيميايي سويه هايي که بيشترين فعاليت آنزيمي را داشتند با روش PCR شناسا يي و ايزوله هاي برتر با روش 16srDNA نيز ارزيا بي و تعيين هويت گرديدند. نتايج نشان داد بهترين و بيشترين ميزان توليد آنزيم در 24 ساعت ،طول موج 500 نانومتر و 37 درجه سانتيگراد به ميزان آنزيم توسط باکتري هاي باسيلوس. تورنجنسيس 45/38mg/dl،آرتروباکتر. نيکوتينا36/62mg/dl، باسيلوس . سرئوس46/08mg/dl بوده است. بنابراين مطالعه حاضر نشان داد که نمونه هاي محيطي حاوي باکتريهاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز مي باشد.
کليد واژه: آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز، باکتري هاي مولد، منابع محيطي، جداسازي و شناسايي مولکولي
فصل اول
مقدمه و کليات تحقيق
1. مقدمه
لوان يا پلي فروکتوز اگزوپلي ساکاريد متشکل از واحد هاي فروکتوزي است(ارناندز و همکاران،2005) 1 که داراي وزن مولکولي 107 دالتون و حدودا از 60000 واحد فروکتوز تشکيل شده است که در اثر آنزيم لوان سوکراز در خارج از سلول باکتري توليد ميشود(آلرگر و همکاران،2006)2. گياهان گلدار لوان را در واکوئل هاي خود به عنوان منبع قندي براي سازگاري با شرايط سرما و خشکي ذخيره مي شود اما در باکتري ها نقش تامين کننده منبع انرژي را ايفا مي کند.(با نگئولا و همکاران،2006)3 برخي باکتريها از قند سوکروز به عنوان منبع کربن استفاده ميکنند و در نتيجه قادر به توليد آنزيم فروکتوزيل ترانسفرازهستند(شاشيکالا و همکاران،2001)4.آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز داراي 2 سوبسترا 2،6 بتا – دي فروکتوزيل و سوکروز است که طي واکنش گليکوزيل ترانسفراز 2 محصول گلوکز و 2،6 بتا – دي فروکتوزيل را توليد مي کند(شاشيکالا و همکاران،2001).
آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز يک آنزيم خارج سلولي با وزن مولکولي 480 دالتون که سبب تسريع انتقال واحد فروکتوزيل به تعدادي از پذيرنده ها از جمله ساکاروز ،آب و پليمر فروکتان مي شود(شاشيکالاوهمکاران،2001؛با نگئولا و همکاران، 2006؛ارناندز و همکاران،2005). فعاليت اين آنزيم در گستر ه هاي از فرآيند ها شامل بقاي باکتري در خاک (باسيلوس سوبتليس) فتو پاتوژنسيس (اروينيا و سودوموناس) همزيستي (باسيلوس پلي ميکسا) و متابوليسم فروکتان در گياهان است(هرناندز و همکاران،1995) 5. اين آنزيم در باکتريهايي همچون ژئو باسيلوس استرئوترموفيلوس ،باسيلوس سرئوس،لاکتو باسيلوس رئوتري،لوکونوستوک مزانتروئيد،استرپتوکوکوس ساليويروس، باسيلوس پلي ميکسا ومخمرهاي همچون آسپرژيلوس و رودوترولا و قارچ توليد مي شود(بنتينگ و همکاران،2001)6. اين آنزيم در صنايع مواد غذايي و داروسازي و همچنين در تشخيص بيماري ديابت و پاتوژنز بيماري پريودنتال استفاده مي شود (پابست و همکاران، 1997؛ آلگر وهمکاران، 2004) 7.
در اين تحقيق استفاده از نمونه هاي محيطي نه تنها سبب استخراج آنزيم مورد نظر بلکه هم در وقت و هم در هزينه صرفه جويي مي شود و راندمان توليد به مراتب بيشتر خواهد شد.
1-1 پرسش اصلي تحقيق
1. آيا امکان جداسازي باکتريهاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز از نمونه هاي محيطي وجود دارد؟
2. آيا باکتريهاي استخراج شده آنزيم مورد نظر را دارند؟
3. آيا پتانسيل مناسبي جهت توليد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز در باکتريهاي محيطي وجود دارد يا خير؟
1-2 فرضيه ها
1.پتانسيل توليد آنزيم ترانسفراز در باکتريهاي محيطي در حضور بقاياي گياهي وجود دارد.
2.ميزان توليد آنزيم بسته به ميزان سوبسترا و دماي محيط متفاوت است
1-3 اهداف تحقيق
1.جداسازي باکتريهاي مولد آنزيم فروکتوزيل ترانسقراز ازنمونه هاي محيطي
2.شناسايي مولکولي و تعيين سکانس ايزوله هاي موثر در توليد آنزيم
3.هدف کاربردي : ايجاد دانش فني توليد آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز
1-4 فروکتوزيل ترانسفراز ميکروبي
فروکتوزيل ترانسفراز هاي ميکروبي، پلي مرهايي هستند که در بيوسنتز فروکتان ميکروبي (لوان، اينولين، و اوليگوساکاريد-قندميوه اي) ، نقش دارند) هرناندز و همکاران،2008) 8. از نظر ساختاري، فروکتوزيل ترانسفراز ميکروبي، دامنه ي کاتاليزوري خانواده ي گليکوزيد هيدروليز 68 را به اشتراک مي گذارند و در هفت گروه که از نظر فيلوژنتيک به هم مربوط مي شوند، گروه بندي مي گردند(هرناندز و همکاران،2008). ژن هاي کدگذاري شده ي فروکتوزيل ترانسفراز در اپرون ها يا گروه هاي مرتبط با ساير ژن هايي سازمان دهي مي شوند که به ترشح متابوليسم کربوهيدرات يا فروکتوزيل ترانسفراز ارتباط دارند (هرناندز و همکاران،2008).بروز ژن فروکتوزيل ترانسفراز ، عمدتا توسط سيستم هاي دوجزئي يا مکانيزم هاي فسفريلاسيون تنظيم مي شوند که به دسترسي سوکرز يا ساير سيگنال هاي محيطي پاسخ مي دهند(هرناندز و همکاران،2008). فروکتان هاي ميکروبي، در ايجاد مقاومت در مقابل فشار محيطي مانند بي آبي، جذب مواد غذايي، تشکيل بيوفيلم و عوامل ويرولانس، نقش دارند(اهرناندز و همکاران،2008). در نتيجه اهميت صنعتي و بيولوژيکي فروکتان ها، فروکتوزيل ترانسفراز ، موضوع تحقيقات فراواني بوده است که براي بهبود فعاليت آنزيمي يا مشخص کردن نقش بيولوژيکي آنها در طبيعت، انجام شده اند(هرناندز و همکاران،2008).
لوان سوکراز ( سوکروز 2,6 ?-D فروکتان 6, ?-D فروکتوزيل ترانسفراز)،از باکتريهاي گرم-مثبت همچون باسيلوس.سابتيليس، باسيلوس.ناتو،باسيلوس.پلي ميکسا، باسيلوس. استرپتوکوکوس. موتانس، استرپتوکوکوس. ساليواروس، اکتينومايسس.ويسکوس،اکتينومايسس.نيوزلندي وگرم-منفي همچون اروينيا. آميلوورا، زايموموناس. موبيليس، استوباکتر.ساب اکسيداز،گلوکونوباکتر. اکسيداز،پانتوا.آگلومرانس، قارچ هاي همانند آسپرژيلوس و رودوترولا جدا شده است(دونا و همکاران،1999)9. فروکتوزيل ترانسفراز 4 واکنش را کاتاليز ميکند،تبديل،هيدروليز،ترانسفروکتوزيل،پليمريزاسيون(هرناندزوهمکاران،2008). فروکتوزيل ترانسفراز سبب تسريع انتقال واحد فروکتوزيل به تعدادي از پذيرنده هاي مختلف مانندآب در واکنش هيدروليز سوکروز، گلوکز در واکنش تبادل، سوکروز يا فروکتان در پلي مريزاسيون استفاده مي کند (شاشيکالا و همکاران،2001). اين آنزيم داراي 3 ويژگي 1: سنتز لوان از سوکروز از طريق واکنش ترانس فروکتوزيلاسيون 2: هيدروليز لوان به مونوساکاريد فروکتوز 3: تبديل فروکتوز به گلوکز (شاشيکالا و همکاران،2001).
فروکتوزيل ترانسفراز داراي 2 سوبسترا سوکروز و 6,2 ?-D فروکتوزيل که طي واکنش گليکوزيل ترانسفراز 2 محصول گلوکز و 6,2 ?-D فروکتوزيل را توليد مي کند(شاشيکالا و همکاران، 2001). اين آنزيم داراي وزن مولکولي 480 کيلو دالتون است و فعاليت اين آنزيم در گستره هاي از فرآيندهايي شامل بقاي باکتري در خاک (باسيلوس.سابتيليس) فتوپاتوژنسيس (اروينيا و سودوموناس) همزيستي (باسيلوس .پلي ميکسا) و متابوليسم فروکتان در گياهان است (هرناندز و همکاران،1995).
1-5 فروکتان ها
فروکتان هاي ميکروبي، از باکتري هاي گرم-مثبت و گرم-منفي، قارچ هاي خانواده ي آسپرژيلوس10 و رودوترولا11، جدا شده اند(دونا و همکاران،1999). چندين تحقيق خوب در مورد متابوليسم فروکتان گياهان و نقش فيزيولوژيکي آنها، نقش هاي سودبخش به عنوان پروبيوتيک ها در تغذيه انسان و حيوان، کاربردهاي صنعتي و بيوسنتزدر گياهان ترانس ژنتيک، تا کنون به چاپ رسيده اند( هان،1990؛ويجن و اسميکنز،1999؛دلزن و همکاران، 2005)12. فروکتان ها بر طبق نوع اتصالي که زنجيره ي فروکتوزيل ?-D گسترده شده با سوکرز تشکيل مي دهد، به عنوان اينولين ها، لوان ها(فلينز در گياهان)، لوان هاي ترکيبي(گرامينان در گياهان) و سريهاي جديد(اينولين جديد و لوان جديد در گياهان)، طبقه بندي مي شوند(شکل 1) (هرناندز و همکاران،2008). اينولين ها، پليمرهاي خطي از فروکتوز با اتصال هستند( فاوکيا و همکاران،2009)13. افزودن باقي مانده هاي فروکتوزيل در اتصال به سوکرز، منجر به تشکيل کستوز-1 مي شود که يک اينولين اوليه مي باشد(هرناندز و همکاران،2008). پليمرهاي اينولين گياهي، درجه اي از پلي مريزاسيون(DP)30 تا 150 باقي مانده هاي فروکتوزيل را دارند درحالي که اينولين هاي ميکروبي، DP معادل با 20 تا 10000 را دارا هستند (هيجوم و همکاران،2006)14. لوان ها نيز پليمرهاي خطي از فروکتوز هستند اما با اتصالات (هرناندز وهمکاران، 2008). لوان داراي وزن مولکولي 107 کيلو دالتون و حدودا از 60000 واحد فروکتوز تشکيل شده است که در اثر آنزيم لوان سوکراز در خارج از سلول باکتري توليد مي شود(خنافري و همکاران، 1389).گياهان گلدار لوان را در واکوئل هاي خود به عنوان منبع قندي براي سازگاري با شرايط سرما و خشکي ذخيره ميکنند اما در باکتري ها نقش تامين کننده منبع انرژي را ايفا مي کند( خنافري و همکاران 1389). افزودن باقي مانده فروکتوزيل به سوکرز با اتصال ، منجر به تشکيل کستوز-6 مي شود که اولين ماده ي واسطه بيوسنتز لوان مي باشد(هرناندز و همکاران،2008). لوان هايي که مبدائ گياهي دارند(فلين ها)DP کوچکتر از 100 براي باقي ماندهي فروکتوزيل دارند، درحالي که لوان هاي ميکروبي، DP بزرگتر از 100 دارند(هرناندز و همکاران 2008). لوان هاي ترکيبي(گراميان ها)، ريشه ي گياهي دارند و داراي باقي مانده ي فروکتوزيل متصل شده ي و مي باشند (هرناندز و همکاران، 200). پيشگام لوان هاي ترکيبي، تتراساکاريد بيفرکوز مي باشد(شکل1) (هرناندز و همکاران،2008). در سري هاي جديد اينولين، واحدهاي فروکتوزيل ?-D، همانند اينولين، توسط اتصال به هم وصل شده اند، اما زنجيره هاي فروکتوزيل، به C1 يا C2 از نيمه گلوکزي سوکرز متصل هستند( لويس 1933)15. چنين اتفاقي براي سري هاي جديد لوان نيز رخ مي دهد که در آن، واحدهاي فروکتوزيل ?-D، توسط يک اتصال به هم وصل شده اند و زنجيره هاي فروکتوزيل به C1 يا C6 از نيمه گلوکزي سوکرز، متصل هستند (هرناندز و همکاران،2008). چون سوکرز پيشگامِ همه ي انواع فروکتان ها ميباشد، آنها اغلب در يک سمت، نيمه گلوکزي دارند(هرناندز و همکاران،2008). زنجيره ي کوچک اوليگوساکاريدها (DP)، اوليگوفروکتوزيد، فروکتواوليگوساکاريد(FOS) يا زنجيره ي کوتاه FOS نام دارند(هرناندز و همکاران،2008).
شکل 1-1 طبقه بندي انواع فروکتان ها بر اساس نوع اتصال زنجيره ?-D فروکتوزيل با سوکروز( هرناندز و همکاران 2008)
1-6 بيوسنتزفروکتان ميکروبي
گياهان حداقل به دو فعاليت آنزيمي مجزا احتياج دارند تا واکنش هاي اوليه و مدت دار در بيوسنتزرا کاتاليز کنند(هرناندز و همکاران،2008). در مقابل، بيوسنتز فروکتان ها، نيازمند يک فعاليت فروکتوزيل ترانسفراز براي هردو واکنش مي باشد(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزيل ترانسفرازهاي بر طبق روال روبرو دسته بندي شده اند: (1)نوع اتصال ميان واحدهاي فروکتوزيل ?-D در پليمر که سنتز مي کنند (2) ويژگي آنزيمي خود(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزيل ترانسفرازهاي ، يک باقي ماندهي فروکتوزيل را به يک مولکول پذيرنده ي سوکرز انتقال مي دهند که اين عمل بر طبق واکنش کلي مي باشد:
O- ? – D – fructofuranosyl – (2 – 1)- -?D-glucopyranoside +) ? -D- fructofuranosyl -[2 1 or 26]( n
– ? -D-fructofuranosyl-(2 -1)- -?-D-glucopyranoside) = o- -? D – glucopyranoside – + (? -D
-fructofuranosyl–[2 1 or 26]( n+1 – ? – D – fructofuranosyl-(2 – 1)- -?D- glucopyranoside
براي لوکونوستوک مزانتروئيد B-512FMC ، يک استثنا رخ مي دهد که به جاي سوکرز، از مالتوز، به عنوان مولکول پذيرنده استفاده مي کند که ارلوز(erlose) تري ساکاريد اوليه را تشکيل مي دهد(کانگ و همکاران 2005)16 . استثناي ديگر در مورد باسيلوس مگاتريوم مي باشد که بتا دي ساکاريد ?-D فروکتوفرانوزيل گلوکوپرانوزيد را سنتز ميکند(هومان و همکاران،2007)17. لوان سوکرازها به بهترين شکل، فروکتوزيل ترانسفرازهاي را توصيف مي کنندو اغلب لوان هاي ميکروبي توسط انتقال يک باقي ماندهي ?-D فروکتوزيل به مولکول پذيرنده(سوکرز يا لوان) با اتصال هاي (2-6)، سنتز مي کند(هرناندز و همکاران 2008). لوان سوکرازهاي ميکروبي، از گيرنده هاي مختلفي استفاده مي کنند، مانند آب(در واکنش هاي هيدروليز سوکرز)، گلوکز(در واکنش هاي متناوب) و سوکرز يا فروکتان (در واکنش هاي پليمريزاسيون). لوان سوکرازِ راهنلا.آکوآتيليس JMC1683، نيز از D – زيلوز، D -آرابينوز ، L -آرابينوز، لاکتوز، مالتوز، مالتوتريوز، سلوبيوز و ملي بيوز، به عنوان پذيرنده استفاده مي کند(هرناندز و همکاران 2008). لوان سوکراز باسيلوس سابتيليس NCIMB11871، از حداقل 10گليکوپرانوزيد متفاوت و چندين دي ساکاريد به عنوان پذيرنده استفاده مي کند(سيبل و همکاران،2006)18. ويژگي هاي جنبشي عمومي آنزيم هاي لوان سوکراز، در جدول شماره ي 1 توضيح داده شده اند.اغلب لوان سوکرازها، آنزيم هاي مونومري با وزن مولکولي 46-73kDa دارند(هرناندز و همکاران،2008).راهنلا.آکوآتيليس، لوکونوستوک.مزانتروئيد و اکتينومايسس.ويسکوس که ديامر تشکيل ميدهند، بيشترين وزن مولکولي را دارا هستند(پابست،1977؛اهتسوکا و همکاران، 1922؛کانگ و همکاران،2005)19.
PI براي لوان سوکرازها ، بين 2.6 تا 5.5 متغير مي باشد، در حالي که مقادير pH بهينه، از 5.0 مي باشد تا 6.2. مقادير Km گزارش شده براي سورکرازلوان ها، از 4.0 تا 160 مول به توان منفي يک مي باشد(جدول شماره يک) (هرناندز و همکاران،2008). يون هاي آهن، به عنوان کوفاکتورها تنها براي لوان سوکراز هاي لاکتوباسيلوس رئوتري20، لوکونوستوک. مزانتورئيد21، همچون باسيلوس سابتيليس22 که نيازمند Ca2+ هستند، گزارش شده است و برخي از گونه هاي باسيلوس. سابتيليس به جاي +Ca2، نيازمند +Fe3هستند(ون هيجوم و همکاران،2004؛ازيمک و همکاران،2005؛ ملارس- آريتا و همکاران،2006؛گاي و همکاران،1983) 23. فعاليت فروکتوزيل ترانسفراز در لوان سوکراز ، توسط يک مکانيزم واکنش پينگ پنگي(رفت وبرگشتي) رخ مي دهد که، در باسيلوس. سابتيليس، گلوکوناستوباکتر ديازوتروفيکوس24 و استرپتوکوکوس ساليواريوس25، تاييد شده است(چامبرت و همکاران،1974؛هرناندز و همکاران،1955؛ سونگ و جاکوس،1999)26.
اينولوسوکرازها، باقي مانده هاي فروکتوزيل ?-D را به پذيرنده هاي سوکرز يا اينولين با اتصالات() انتقال مي دهند(هرناندز و همکاران 2008).اگرچه اينولين يک فروکتان گياهي مشخص و نمونه اي است، اما لاکتوباسيلوس. رئوتري، لوکونوستوک سيترئوم27 و استرپتوکوکوس موتان28 نيز، فعاليت هاي اينولوسوکراز از خود نشان مي دهند(هيجوم و همکاران، 2002؛اوليور- ايلانا و همکاران،2003؛ابيسو و همکاران، 1975)29.وزن هاي مولکولي اينولوسوکراز از لاکتوباسيلوس.رئوتري و لوکونوستوک. سيترئوم 85 و 170کيلو دالتون، PI آنها4.5 و 5.0، pH بهينه آنها 5.0 . 6.5 و Km آنها براي سوکرز به ترتيب 21.0 و 66.0 مول مي باشد(هرناندز و همکاران،2008). براي اينولوسوکراز استرپ. موتان، هيچ مشخصه جنبشي، گزارش و ثبت نشده است(هرناندز و همکاران،2008). مکانيزم هاي واکنش براي اينولوسوکرازها مشخص نشده اند و گزارشي مبني بر استفاده از آب يا گلوکز به عنوان پذيرنده هاي فروکتوزيل جايگزين، ارائه نشده است(هرناندز و همکاران،2008).
همچنين، فروکتوزيل ترانسفرازهاي ، سنتز لوان را نيز کاتاليز مي کند اما آنها هيدروليز را کاتاليز نمي کنند يا مانند لوان سوکرازهاي ، واکنش ها را تبادل نمي کنند(هرناندز و همکاران،2008). ويژگي هاي جنبشي فروکتوزيل تراسنفراز ، در جدول شماره 1، فهرست شده اند. وزن هاي مولکولي مابين 75 و 180 کيلو دالتون، pH بهينه 4.5-7.5، و مقادير km براي سوکرز، 5.0-770.4 مول مي باشند(هرناندز و همکاران،2008). آنزيم هاي رودوترولا LEB-V10 و آسپرژيلوس آکولئاتوس، از نوع ديمري مي باشند(قاضي و همکاران،2007؛ هرنال استينس و مايوگري،2008)30
جدول 1-1 بررسي ويژگي هاي جنبشي آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز در باکتري هاي مولد آنزيم(هرناندز و همکاران،2008)
OrganismEnzyme* Substrate ProductMr (kDa) T (C)§ pH§ pI Km Suc-ReferenceBacillus subtilisLevSucLen75.0305.5nd4.0Gay et al. 1983 ; Van Hijum et al. 2004Paenibacillus polymyxaLevSucLen, 1-knd30ndndndBezzate et al. 2000Bacillus megateriumLevSucLen, 1-k, 6-k, 52.0456.0nd6.6Homann et al. 2007Erwinia amylovoraLevSucLen46.028nd4.0ndGeier and Geider 1993Gluconacetobacter diazotrophicusLevSucLen, 1-k, nys58.0305.05.511.8Herna´ndez et al. 1995Lactobacillus sanfranciscensisLevSucLen, 1-k73.0355.4nd13.1Tieking et al. 2005Leuconostoc mesenteroidesLevSucLen90.0306.0nd36.7Morales-Arrieta et al. 2006Leuconostoc mesenteroidesLevSucLen103.0306.2nd26.6Kang et al. 2005Pseudomonas s. phaseolicolaLevSucLen45.0186.23.5160.0Hettwer et al. 1995Rahnella aquatilisLevSucLen120.0606.0nd50.0Ohtsuka et al. 1992Zymomonas mobilisLevSucLen56.0505.02.6122.0Yanase et al. 1992Lactobacillus reuteriLevSuc, rafLen63.8504.5nd21.0Van Hijum et al. 2004Lactobacillus reuteriInsSucInu, nys85.0505.0ndndVan Hijum et al. 2002Leuconostoc citreumInsSuc, mal, lac Inu170.0456.55.066.0Olivares-Illana et al. 2002Streptococcus mutansFftSucInu97.0ndndndndSchroeder et al. 1989Streptococcus salivariusFftSuc, rafLen125.4376.0nd5.0Song and Jacques 1999Actinomyces viscosusFftSuc, rafLen220.0377.54.212.0Pabst 1977Aspergillus aculeatusFtfSuc, raf 1-k, nys, fructosylnystose170.0655.5nd27.0Ghazi et al. 2007Aspergillus foetidusFftSuc1-k, nys180.0ndndndndRehm et al. 1998Aspergillus sydowiiFftSucInu75.0ndndndndHeyer and Wendenburg 2001Rhodotorula sp.FtfSuc1-k, nys, fructosylnystose170.0674.5nd770.4Hernalsteens and
Maugeri 2008*Lev, levansucrase; Ins, inulosucrase; Ftf, fructosyltransferase.
Suc, sucrose; raf, raffinose; mal, maltose; lac, lactose.
Len, levan; 1-k, 1-kestose; 6-k, 6-kestose; nys, nystose; inu, inulin.
§T and pH indicate optimal temperature and pH values.
-Km values are expressed in mmol l)1.
1-7 ساختار فروکتوزيل ترانسفراز
لوان سوکرازهاي ميکروبي، اينولوسوکراز و فروکتوزيل ترانسفراز ، که فروکتان ها را سنتز مي کنند، به خانواده ي گلکوزيد هيرولاز 68 تعلق دارند(هرناندز و همکاران 2008). فروکتوزيل ترانسفرازهاي ، پنج دامنه ي اصلي را به اشتراک مي گذارند: (1) يک پپتيد سيگنالي(در باکتري گرم-مثبت و گلوکوناستوباکتر.ديازوتروفيکوس)، (2) يک دامنه ي N ترمينال که از نظر طول متغير است، (3) يک دامنه ي کاتاليزوري با ميانگين طول 500 آمينواسيد، (4) يک محدود از اتصال ديوار سلولي ( در برخي از باکتري هاي گرم -مثبت) و (5) منطقه اي با طول متغير در دامنه ي C ترمينال (هيجوم و همکاران،2006). پپتيدهاي سيگنالي در دامنه ي N ترمينال از باکتري گرم-منفي، تنها براي لوانِ سوکراز گلوکوناستوباکتر . ديازوتروفيکوس، گزارش شده اند(هرناندز و همکاران،2008). آنها در 30 آمينواسيد ابتدايي واقع شده اند که توسط سيستم ترشح نوع II شناسايي شده اند( آريتا و همکاران،2004)31. ساير فروکتوزيل ترانسفرازهاي از باکتري گرم-منفي ممکن است از طريق مسيرهاي متفاوت ترشح شوند(هرناندز و همکاران،2008). همچنين، در فروکتوزيل ترانسفرازهاي از باکتري گرم-منفي، يک بخش هاي حفظ شده در دامنه ي N ترمينال وجود دارد و داراي توالي WT(R/I)ADA(L/M) مي باشد که، در پروتئين هاي واقع شده در وسط غشا نيز وجود دارد(تاجيما و همکاران،2000)32. دامنه ي N ترمينال فروکتوزيل ترانسفرازهاي ، عموما طولي با 90آمينواسيد دارد(هرناندز و همکاران،2008).در لوان سوکراز لاکتوباسيلوس سانفرانسيسنسيس33TMW1.392، دامنه ي N ترمينال داراي توالي 16 آمينواسيد(DNATSGSTKQESSIAN) مي باشد که هفت بار تکرار مي شود (تيکينگ و همکاران،2005).لاکتوباسيلوس رئوتري، لوکونوستوک.مزانتروئيد،استرپتوکوکوس.موتان،واسترپتوکوکوس. ساليواريوس، توالي هايي را نشان مي دهند که طولي يکسان دارند اما، از نظر توالي آمينو اسيد باهم مشابه نيستند،اگرچه، داراي مقداري باقي مانده حفظ شده مي باشند(هرناندز و همکاران،2008).احتمال مي رود که، بخش ها هفت بار تکرار شده، در لاکتوباسيلوس. سانفرانسيسنسيس، به صورت کارکردي باقي بماند، اما اين کارکرد(نقش) ممکن است در ساير باکتري ها، از بين برود(هرناندز و همکاران،2008). دامنه هاي کاتاليزوريِ فروکتوزيلِ ترانسفرازهاي ميکروبي، داراي 11 توالي موتيف هستند که درجدول شماره 2 توضيح داده شده اند(منگ و فيوتر،2003)34. باقي مانده ي که در اتصال Ca2+ در لوان سوکراز لاکتوباسيلوس. رئوتري نقش دارد، به عنوان D339 شناسايي شده است و براي اينولوسوکراز و لوان سوکراز، باقي مانده هاي متناظر نيز به عنوان D520 و D500 در نظر گرفته شده اند( ازيمک و همکاران 2005)35. جالب اينجاست که،باقي مانده D تنها در فروکتوزيلِ تراسنفراز منشاء گرم-مثبت حفظ شده است (ازيمک و همکاران،2005). دامنه ي اتصال ديوار سلولي در C ترمينال باکتري گرم-مثبت، شامل يک موتيفPXX مي باشد(يک موتيف شناسايي سورتاز LPXTG حفظ شده، ويک منطقه ي (هيدروفوبيک) دامنه ي C ترمينال از پروتئين هاي ثابت شده با ديوار سلولي از باکتري گرم-مثبت) (تيکينگ و همکاران،2005). در فروکتوزيل ترانسفراز هاي دامنه ي C ترمينال از باکتري گرم-منفي، ناحيه اي غني از گليسين وجود دارد که با پروتئين هاي اتصال گلوکان، مشابه است(سونگ و همکاران،1998)36.
ساختار سه بُعديِ جايگاه کاتاليزوريِ فروکتوزيل ترانسفرازهاي ، از کريستالوگرافي اشعه ي X لوان سوکراز باسيلوس. سابتيليس و گلوکوناستوباکتر . ديازوتروفيکوس، بدست آمد(منگ و فيوتر،2003؛مارتينز -فليتز و همکاران، 2005)37.
لوکونوستوک سيترئوم38CW28 بزرگترين فروکتوزيل ترانسفراز گزارش شده تا کنون مي باشد و سه دامنه شبيه به دامنه هاي ترانسفرازگليکوزيل، ارائه مي دهد(هرناندز و همکاران، 2008). اولين دامنه در 138 آمينواسيد از دامنه ي N ترمينال واقع شده است و شباهت کمي به آلترنان سوکرازِ لوکونوستوک. مزانتروئيد دارد(هرناندز و همکاران،2008). دومي، دامنه ي کاتاليزوري مي باشد که موجب فعاليت اينولوسوکراز مي شود و با لوان سوکراز باسيلوس. سابتيليس، مشابه است(هرناندز و همکاران،2008).سومين دامنه، هويت بالايي را با يک دامنه ي C آلترنان سوکراز نشان مي دهد که مسئول اتصال پليمري(بسپار) مي باشد(اليور-ايلانا و همکاران، 2003)39. آلترنان-سوکراز، گلوکان هاي سوکرز را به همراه اتصالات ?(1 و (? بيوسنتزمي کند(هرناندز و همکاران 2008).بيان نسخه ي کوتاه شده ي C ترمينال لوکونوستوک سيترئوم در يولوسوکراز، که شامل دامنه ي کاتاليزوري فروکتوزيل ترانسفراز مي باشد، باعث افزايش فعاليت آنزيم و کاهش پايداري حرارتي در 40 درجه سانتيگراد مي شود(هرناندز و همکاران،2008). دامنه ي C ترمينال در اينولو سوکراز لوکونوستوک. سيترئوم، که با آلترنان سوکراز هم زنجيره مي باشد، ممکن است سرعت واکنش خود را کاهش و پايداري حرارتي خود را افزايش دهد(هرناندز و همکاران،2008). اين آنزيم شيميايي، ممکن است از طريق نوترکيبي ميان ژن هاي وابسته به سوکرزِ ترانسفرازگليکوزيل با فعاليت هاي آلترنان سوکراز و اينولوسوکراز، توليد شود(اليور-ايلانا و همکاران،2003).
تحليل فيلوژنتيک پروتئين هاي فروکتوزيل ترانسفرازميکروبي، نشان داده است که آنها در هفت گروه اصلي گروهبندي شده اند، A تا G(شکل 2) (هرناندز و همکاران،2008). گروه A با فروکتوزيل ترانسفراز از باکتري ميکروبي ?و ي نوع بورخولدريا40 و گلوکوناباکتر .ديازوتروفيکوس و طبقه ي GC باکتري هاي اکتينوباکترها، مطابقت دارند(هرناندز و همکاران،2008).گروه B تشکيل شده است از لوان سوکرازهاي حاصل از زنجيره هاي مختلفِ پروتئين باکتري ? زيموموناس41 و باکتري اسيداستيکي گلوکونوباکتر اکسيدانز42 و گلوکونوستوباکتر زيلينوس43. گروهC، تشکيل شده است از لوان سوکرازهاي باکتري پروتئينيي نوع سودوموناس44، اروينيا آميلوورا45، راهنلا.آکوآتيليس و از لوکونوستوک. مزانتروئيد گرم-مثبت(هرناندز و همکاران،2008). گروهD، شامل لوان سوکرازهاي اسفينگو-مونادالز46، کاولوباکتر اس پي47. گروه E، از لوان سوکرازهاي رده ي باسيلوس ها و کلستريديوم ها تشکيل شده است(هرناندز و همکاران،2008). گروهF، مشتمل بر لوان سوکراز و اينولوسوکرازهاي لاکتوباسيلوس ها48 است(هرناندز و همکاران،2008). گروه هفتم که بسيار متفاوت نيز مي باشد، يعني گروهG، تشکيل شده است از فروکتوزيل ترانسفرازهايي که منشايي يوکاريوتي دارند و توالي آنها همولوگ مي باشد، يعني آرتروباکتر آروسنس49 و پائني باسيلوس پلي ميکزا50(هرناندز و همکاران،2008). لوان سوکراز از اوشنيکولا گرانولوسوس51، به طور مشخص توسط مقدار خودايستاي بالا از گروه هاي قبلي جدا شده است و ميان گروه F و G قرار گرفته است(هرناندز و همکاران،2008).
توزيع فروکتوزيل ترانسفراز که در شکل 2 به نمايش گذاشته شده است، با مشاهدات انجام شده توسط پانز و همکاران(2000)، همبستگي دارد. هر گروه در شکل 2، تقريبا به صورت کامل از فروکتوزيل ترانسفراز هاي ارگانيسم هايي تشکيل شده است که از لحاظ فيلوژني ، به هم ارتباط دارند(پانز و همکاران،2000).يک استثنا براي لوان سوکراز از لوکونوستوک.مزانترئيد گرم-مثبت مشاهده شده است که درگروه C با لوان سوکرازهاي گرم-منفي قرار دارد(هرناندز و همکاران،2008) . لوان سوکراز لوکونوستوک مزانتروئيد52، مي تواند با استفاده از انتقال افقي ژن از باکتري گرم-منفي، حاصل شود(هرناندز و همکاران،2008). در حقيقت اين لوان سوکراز، با مورد سودوموناس آورانتيکا53 مشابه است. حدس زده مي شود که، ژنوم ها از باکتري هاي نوع سودوموناس پويا هستند و پيدا کردن ژن هاي تکراري و کپي شده در ژنوم آنها، رايج است. اينولوسوکراز بزرگِ لوکونوستوک. سيترئوم که شامل دامنه هاي مرتبط از نظر آلترنان سوکراز مي باشد، به صورت نزديکي با لوان سوکراز از لوکونوستوک.مزانتروئيد در ارتباط است، در نتيجه، منشاء متنوع خود را نشان مي دهد(هرناندز و همکاران،2008). هردو لوان سوکراز ديمري از راهنلا.آکوآتيليس JCM-1683 و از لوکونوستوک.سيترئوم CW28، به ترتيب، به گروه هاي C و F تعلق دارند(اليور-ايلانا و همکاران،2002؛اهتسوکا و همکاران،1992)54. آرتروباکتر آروسنس، کلستريديوم آستوبوتيليکوم55 و چندين پاتووارِ56 سودوموناس سيرينگا57، شامل دو يا چند کپي از ژن هاي کدگذاري لوان سوکراز هستند(هرناندز و همکاران،2008). در دو مورد اول، هر دو کپي ژني، در گروه هاي فروکتوزيل ترانسفرازمتفاوت گروهبندي مي شوند، در حالي که کپي هاي پاتووارِ سيرينجا، همگي در گروه C گروه بندي مي شوند(هرناندزوهمکاران،2008). ژنهاي پارالوگ سودوموناس.سيرينجا، به جايگاه هاي خارج سلولي و سيتوسل،قرار مي گيرند(لي و الريچ،2001)58. از سوي ديگر، دو سويه از لوکونوستوک.مزانتروئيدها، شامل يک لوان سوکراز هستند که متعلق به گروه C مي باشد و يک فروکتوزيل ترانسفرازکه متعلق به گروه G مي باشد(هرناندز و همکاران،2008). اين مطلب در مورد لوان سوکراز و فروکتوزيلِ ترانسفراز سويه هاي مختلفِ باسيلوس.پلي ميکزا صدق مي کند که، در گروه هاي E و G قرار گرفته اند(هرناندز و همکاران،2008). اين مشاهدات، اين فرضيه که ژن هاي کدگذاري فروکتوزيل ترانسفراز با استفاده از کپي شدن ژن و انتقال افقي ژن، دگرگون مي شوند را پشتيباني مي کند(هرناندز و همکاران،پ2008). سه گروه بزرگتر از فروکتوزيل ترانسفرازتوسط، باکتري گرم-منفي(گروه هاي A تا D)، باکتري گرم-مثبت(گروه هاي E و F) و قارچ ها(گروه G) (هرناندز و همکاران،2008). درميان فروکتوزيل ترانسفراز باکتريايي که به خانواده ي GH68 تعلق دارند، بخش هاي دامنه ي کاتاليزوري، حفظ شده اند(جدول 2) در حالي که فروکتوزيل ترانسفراز هاي قارچي که به خانواده ي GH32 تعلق دارند وشامل سوکراز و فروکتوزيل ترانسفراز مي شوند، تنها بخش نشانه اي را براي فروکتوزيل ترانسفراز به اشتراک مي گذارند.اين بدان معنا است که، منشايي منوفيليک وجود دارد(هرناندز و همکاران،2008).
شکل 1-2 توزيع آنزيم فروکتوزيل ترانسفراز در 7 گروه از نظر فيلوژنتيک(هرناندز و همکاران،2008)
1-8 سازمان دهي ژني فروکتوزيل ترانسفراز هاي ميکروبي
ژن هاي لوان سوکراز در باکتري هاي زايموموناس.موبيليس و گلوکونوباکتر.ديازوتروفيکوس و باسيلوس.سابتيليس، دراپرون هاي فرضي وابسته ، در گرو ه هايي با ساير ژن ها يا اپرون ها، سازماندهي شده اند(شکل3) (هرناندز و همکاران،2008). ژن کدگذاري لوان سوکراز در زايموموناس.موبيليس B4286، levU(sacB)، يک اپرون با جايگاه کروموزوم با يک ژن کدگذاري سوکراز invB(sacC)، تشکيل ميدهد(هرناندز و همکاران 2008). سوکرز، بيان اپرون را به عنوان بيسيسترونيکmRNA القا مي کند(سونگ و همکاران،1999)59. منطقه ي پروموتري کاتاليزور در 5’ژن levU(sacB) قرار گرفته است که توسط يک ساختار ساقه-حلقه اي، دنبال مي شود که يک خاتمه رونويسي را شبيه سازي مي کند(هرناندز و همکاران،2008). در نتيجه، حدس زده مي شود که، بيان invB(sacC) توسط يک مکانيزم ضد خاتمه، کنترل مي شود(هرناندز و همکاران،2008). در منطقه اي که 5′ اپرون invB -levU قرار گرفته است، اپرون glk قرار دارد که چهار آنزيمِ مسير گليکوليزي را کدگذاري مي کند(هرناندز و همکاران 2008).دو چهارچوب خواندن باز(ORF)،در ميان هردو اپرون قرار گرفته اند(هرناندز و همکاران،2008). ORF3، يک پروتئين مشابه با خانواده ي Lpr از پروتئين هاي تنظيم کننده را کدگذاري مي کند که موتيف هاي اتصال DNAحلزوني-چرخش-حلزوني را به اشتراک مي گذارند که بيوسنتز و کاهش آمينواسيد را کنترل مي کند(هرناندز و همکاران،2008).ORF4، پروتئيني را کدگذاري مي کند که با ريسميز(ملح) آسپارتات60 از آراکاگلوبوس فلوگيدوس61، هم ساخت است (سونگ و همکاران،1999). لوان سوکراز و سوکراز از موبيليس، به ترتيب با 30% و 70%، به فعاليت هيروليزي سوکرز خارج سلولي، کمک مي کنند(هرناندز و همکاران،2008).موتانت هاي levU همچنان قادر به رشد در سوکرز به عنوان تنها منبع کربن، هستند اما آنها نمي توانند لوان را و سطوح بالاي اتانول را ذخيره کنند(کانان و همکاران،1995)62. اين نشان مي دهد که، محصولات هيدروليز سوکرز، در غياب فعاليت بيوسنتز لوان، به کاتابوليسم تخميري منحرف مي شوند(هرناندز و همکاران، 2008). در مقابل، موتانت هاي invB، سه برابر لوان بيشتر از نوع وحشي ذخيره مي کنند و توليد اتانول، کاهش مي يابد( سنتيل کومار و همکاران،2004)63.
ژني که لوان سوکراز ديازوتروفيکوس SRT4 را کدگذاري مي کند، به عنوان بخشي از اپرون فرضي، در کروموزوم قرار گرفته است، به همراه ژني که يک لواناز خارجي64 را کدگذاري مي کند، يک آنزيم هيدرولز-لوان. پايانه ي 3′ از ژن lsdA شامل يک ساختار ساقه حلقه اي است که خاتمه را شبيه سازي مي کند که احتمالا بيان ژن lsdB را کنترل مي کند(هرناندز و همکاران،2008). گزارش شده است که، بيان ژن lsdA، سازنده است، درحالي که منطقه بدون کد 5′ شامل توالي همزمان رسمي براي تشديدکننده هاي عمل کاتاليزور پروکاريوت نمي باشد( هرناندز و همکاران ،2000)65.مشخص نيست که تحت چه شرايطي lsdB بيان و رونويسي شده است و اينکه آيا اصلا قابل رونويسي مي باشد(هرناندز و همکاران،2000). در نزديکي پايانه ي 3′ از lsdB، گروهي از ژن ها وجود دارد که اجزاي سيستم ترشح نوع 2 را کدگذاري مي کند و احتمالا يک اپرون تشکيل مي دهد( آريتا و همکاران 2004). سيستم هاي ترشح نوع دو، در ترشح توکسين و آنزيم خارج سلولي در باکتري گرم-منفي، نقش دارند(ام.ال. ولازگوئز-هرناندز و همکاران،2008). نقش سيستم ترشح نوع 2 در ترشح لوان سوکراز در ديازوتروفيکوس، توسط اختلال ژن lsdG,lsdO و lsdF، نشان داده شده است که، ذخيره خارج سلولي لوان را کاهش مي دهد و فعاليت درون سلولي لوان سوکراز توسط عامل 4، افزايش مي دهد(آريتا و همکاران،2004)66. اين همکاريِ lsdA-lsdB و اپرون هاي فرضي سيستم ترشح نوع 2، در يک مکان و ارتباط آنها با ترشح لوان سوکراز، نشان مي دهد که، آنها بخشي از ناحيه ژنومي هستند که با متابوليزم لوان، ارتباط دارند(هرناندز و همکاران،2008).
ژني که لوان سوکراز باسيلوس. سابتيليس QB112 را کدگذاري مي کند، به عنوان يک بخش يا يک اپرون تريسيسترونيک، در کروموزوم واقع شده است(پريرا و همکاران،2001)67. همانند مثالهاي قبلي، يک ساختار با ساقه ي حلقه اي وجود دارد که يک خاتمه رونويسي را شبيه سازي مي کند(هرناندز و همکاران، 2008). ساختارهاي يکساني در پايانه هاي 3′ از yveB و yveA وجود دارند(شکل 3c) (هرناندز و همکاران،2008). yveB يک اندولواناز را کدگذاري مي کند که لوانيوبيوز از لوان را توليد مي کند(هرناندز و همکاران 2008). مشخصا، لوانيوبيوز توسط باسيلوس. سابتيليس، سوخت و ساز نمي شود، در نتيجه، نشان مي دهد که به عنوان يک مولکول منفرد مورد استفاده قرار مي گيرد(داگوئر و همکاران 2004)68. yveA براي يک پروتئين غشايي فرضي با کارکرد نامشخص، کدگذاري مي کند(داگوئر و همکاران،2004).
سودوموناس .فاسئوليکولا PG4180 شامل سه ژن



قیمت: تومان


پاسخ دهید