دانشکده شيمي
پايان نامهي دوره کارشناسي ارشد در رشته شيمي تجزيه
موضوع:
اصلاح الکترود خميرکربن با نانو ذرات SiO2 و کاربرد آن به عنوان زيست حسگر الکتروشيميايي در بررسي برهمکنش ساختار DNA-i-motif با تاموکسيفن و اندازهگيري الکتروشيميايي آن
استاد راهنما:
دکتر جهانبخش رئوف
استاد مشاور:
دکتر رضا اوجاني
نام دانشجو:
الهام حيدري
بهمن 1393
تقدير وتشکر
خداي مهربان را شاکرم که هرنفسم و هر قدمم به لطف و عنايت اوست هرچه داد از کرمش و هر چه نداد از حکمتش بود.چه زيباست ستايش خالق، در حالي که تقدير از مخلوق ، جنبه اي از ستايش خالق است.شکل گيري و به بار نشستن اين تحقيق مديون راهنماييهاي استاد ارجمندم جناب آقاي دکتر جهانبخش رئوف ميباشد که در تمامي مراحل راه را برمن ، هموار نمودند و علم خود را بيدريغ در اختيارم نهادند. از ايشان به خاطر زحماتي که در اين مدت متحمل گرديدند صميمانه سپاسگذارم.
همچنين از جناب آقاي دکتر رضا اوجاني استاد مشاور گرامي که در طي انجام اين تحقيق مرا ياري دادند قدرداني ميکنم.
برخودلازم ميدانم از اساتيد بزرگوار جناب آقاي دکتر حاج محمدي و دکتر عزيزي که داوري اين پايان نامه را بر عهده داشتند، تشکرنمايم.
تقديم به
پدر و مادر عزيزم
گوهرهايي بي همتا
در بحر بي دريغ فداکاريها که وجودشان برايم همه عشق است و وجودم برايشان همه رنج
چکيده
تلومرها كمپلكسهايي متشكل از DNA و پروتئين ميباشند كه نقش مهمي را در جهشهاي ژني و ايجاد سرطان دارند. آنزيم تلومراز، طول كروموزوم را از طريق سنتز تلومرها افزايش داده و در حدود 85% از سرطانها فعال است. در انتهاي تلومرها يك دو رشتهاي DNA با توالي (5-TTAGGG):(5-CCCTAA) وجود دارد. رشته غني از سيتوزين قادر است ساختار i-motif DNA را تشكيل دهد. مطالعات نشان داده است كه با پايدار كردن اين ساختار ميتوان از تشكيل ساختار دو رشتهاي و در نتيجه طويل شدن طول تلومرها جلوگيري كرد. داروي تاموكسيفن يک عامل هورموني ضد استروژن براي درمان سرطان سينه ميباشد كه براي مدت زيادي به منظور درمان سرطان سينه به كار ميرود. در اين تحقيق در مرحله اول امکان اندازهگيري الکتروشيميايي داروي تاموکسيفن سيترات در سطح الکترود خمير کربن اصلاح شده با نانو ذرات 2SiO به کمک ولتامتري پالس تفاضلي و ولتامتري چرخهاي مورد مطالعه قرار گرفت و سنجش مقدار تاموکسيفن در نمونه حقيقي به کمک روش افزايش استاندارد صورت پذيرفت. در مرحله دوم، با طراحي زيست حسگرهايي بر مبناي ساختار i-motif، برهمکنش اين ساختار با داروي ضد سرطان تاموکسيفن سيترات، مورد بررسي قرار گرفت. زيستحسگر الکتروشيميايي از طريق اصلاح الکترود خمير کربن (CPE) با نانوذرات 2 SiOو -L سيستئين سپس تثبيت ساختار i-motif DNA بر روي سطح تهيه شد و براي بررسي برهمكنش اين ساختار با داروي تاموكسيفن به كار گرفته شد. پايداري ساختار i-motif ، يک استراتژي خوب براي درمان سرطان است، چون ميتواند از واکنش تلومراز در سلول سرطاني جلوگيري کند. برهمکنش بينi-motif DNAو دارو تاموکسيفن، در بافر فسفات M 1/0(PBS) و محلول3[Fe (CN)6]- از طريق ولتامتري چرخهاي (CV) و روش ولتامتري موج مربعي (SWV) مورد مطالعه قرار گرفت. دماغه اکسايشي تاموکسيفن بعد از تثبيتDNA i-motif روي سطح الکترود به دليل برهمکنشDNA i-motif و تاموکسيفن مشاهده شد و با افزايش غلظت داروي تاموکسيفن، سيگنال افزايش مييابد. از روش طيفبيني دورنگ نمايي دوراني (CD) براي بدست آوردن اطلاعاتي در مورد نحوه شکلگيري ساختار و برهمکنش ليگاند با اين ساختار مورد بررسي قرار گرفت و نتايج نشان داد که اين ساختار در pH حدود 5/4 ساخته شده، ولي پايداري آن با افزايشpH محيط کاهش مييابد. حد تشخيص کاوشگر تثبيت شده بر سطح الکترود خمير کربن اصلاح شده بر مبناي سه برابر انحراف استاندارد برابرm ? 06/0 تعيين شد.
واژگان کليدي: زيست حسگر الکتروشيميايي DNA ، تاموکسيفن، سلولهاي سرطاني، ساختار i-motif DNA
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
مقدمه2
فصل دوم: تئوري
2-1- الکترودهاي اصلاح شده شيميايي11
2-2- حسگرها13
2-3- حسگرهاي الکتروشيميايي13
2-4- زيست حسگرها15
2-5- زيست حسگرهاي الکتروشيميايي DNA16
2-6- ساختار مولکول DNA18
2-6-1- DNA سه رشتهاي23
2-6-2- DNA چهار رشتهاي24
2-6-2-الف- G-DNA24
2-6-2- ب- i-motif25
2-7- کاوشگرها و تثبيت آنها بر سطح مبدل26
2-7-1- تثبيت DNA کاوشگر از طريق جذب سطحي26
2-7-1-1 جذب سطحي فيزيکي27
2-7-1-2- جذب سطحي در پتانسيل کنترل شده27
2-7-1-3-تثبيت DNA بوسيله اتصال کوالانسي27
2-8- انواع برهمکنش ميان نشانگرها و DNA28
2-8-1- برهمکنش الکترواستاتيک28
عنوان صفحه
2-8-2- برهمکنش درون رشتهاي28
2-8-3- برهمکنش با شيار28
2-9- تلومر29
2-10- آنزيم تلومراز29
فصل سوم: بخش تجربي
3-1-مواد شيميايي مورد نياز32
3-2-وسايل و تجهيزات34
3-3- الکترودهاي مورد استفاده35
3-4-تهيه الکترودهاي کار35
3-4-1- تهيهي الکترود خمير کربن برهنه (CPE)35
3-4-2- تهيه الکترود خمير کربن اصلاح شده با نانوذرات 2 SiO و -L سيستئين / L -Cys) 2NSiO)36
3-5- بافرهاي مورد استفاده براي تثبيت pH 37
3-6- تهيه محلولها38
3-7- مشخصهيابي سطح الکترود38
فصل چهارم: اصلاح الکترود خمير کربن با نانو ذرات 2 SiO و کاربرد آن براي تعيين الکتروشيمايي داروي تاموکسيفن سيترات
4-1- مطالعه ولتامتري چرخهاي الکترودهاي کار41
4-2- مطالعه اسپکتروسکوپي امپدانس الکتروشيميايي42
4 -3- اثر pH محلول بافر به رفتار الکتروشيميايي تاموکسيفن سيترات در سطح /CPE 2SiO 44
4-4- بررسي رفتار الکتروشيميايي محلول تاموکسيفن سيترات در سطح الکترودهاي خمير کربن اصلاح شده با نانو ذرات
عنوان صفحه
2 SiO………………………………………………………………………….45
4-5- اثر سرعت روبش پتانسيل بر رفتار الکتروشيميايي تاموکسيفن سيترات در سطح /CPE 2SiO 46
4-6- تعيين محدوده خطي غلظتي تاموکسيفن سيترات و حد تشخيص روش48
4-7- اندازهگيري تاموکسيفن سيترات در نمونه حقيقي به کمک روش پيشنهادي50
فصل پنجم: اصلاح الکترود خمير کربن با نانو ذرات /L-Cys 2 SiO و کاربرد آن به عنوان زيست حسگر الکتروشيميايي در بررسي برهمکنش ساختار DNA-i-motif باتاموکسيفن
5-1- کليات53
5-2- اهميت ساختار i-motif DNA53
5-3- ويژگيهاي CPE/2NSiO / i-Motif DNA56
5-3-2- مطالعه ولتامتري چرخهاي چگونگي تثبيت DNA بر روي سطح الکترود اصلاح شده58
5-4 -مطالعه رفتار الکتروشيميايي تاموکسيفن در سطح زيست حسگر الکتروشيميايي59
5-4-1- ولتامتري چرخهاي59
5-4-2- ولتامتري موج مربعي61
5-5 – اثر pH بر رفتار الکتروشيميايي تاموکسيفن در سطح63
5-6- بررسي طيف سنجي CD65
5-7- نتيجهگيري 67
نتيجهگيري نهايي68
پيشنهادات براي کارهاي آينده69
مراجع70
چکيده انگليسي
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 2-1- ساختار يک حسگر الکتروشيميايي نوعي15
شکل 2-2- مراحل تشخيص DNA17
شکل 2-3- شمايي از يك كروموزوم و زنجير دورشتهاي DNA موجود در داخل كروموزوم و همچنين بازشدة قسمتي از DNA با نشان دادن پيوند فسفودي استر بين دو قند پنتوز و همچنين پيوند هيدروژني بين بازهاي آلي در ساختار دورشته‌اي) parsianshiraz.blogspot.com) DNA.21
شکل2-4- ساختارهاي متفاوت DNA 22
شکل2-5- ساختار چهار رشتهاي G-quderplux25
شکل2-6- ساختار چهار رشتهاي i-motif DNA-26
شکل 3-1-الف) فرمول ساختاري و برخي از ويژگيهاي تاموکسيفن سيترات و ب) ساختار L- سيستئين33
شکل ?-2- (الف) دستگاه پتانسيواستات / گالوانواستات اتولب و (ب) سل آزمايشگاهي35
شکل3- 3- نمايش نموداري از تهيه الکترود خمير کربن اصلاح شده37
شکل4-1- ولتاموگرامهاي چرخهاي محلول -4/-3[6(CN)[Fe M 01/0 داراي NaCl M 1/0 در سطح (a) CPE و(b) /CPE 2SiO در سرعت روبش 1-s mV 5041
شکل 4-2- نمودار نايکويست مربوط به الکترود خمير کربن برهنه (a) و الکترود خمير کربن اصلاح شده با نانو ذرات 2SiO (b) در محلول M 01/0 از زوج اکسنده/کاهنده ]6(CN)[Fe4K/]6(CN)[Fe3 Kحاوي NaCl M 1/0 با سرعت روبش 1-s mV 10043
شکل 4-3- اکسايش برگشت ناپذير تاموکسيفن سيترات44
شکل 4-4- نمودار شدت جريان دماغه اکسايش M 5-10 تاموکسيفن سيترات در سطح CPE/ 2SiO بر حسب pH محلول بافر فسفات M 1/0 45
عنوان صفحه
شکل 4-5- ولتاموگرامهاي چرخهاي الکترود خمير کربن برهنه (a) و خمير کربن اصلاح شده با نانو ذرات 2SiO (b) در محلول بافر فسفاتM 1/0 با 5/4 pH= دارايM 1/0 NaCl در سرعت روبش پتانسيل 1-s mV 50. (c) نظير (a) و (d) نظير (b) در حضور M 5-10 از تاموکسيفن سيترات46
شکل 4-6- الف) ولتاموگرامهاي چرخهاي محلول M 5-10 از تاموکسيفن سيترات در محلول بافر فسفات M 1/0 با 5/4PH= داراي M 1/0 NaCl در سرعتهاي روبش پتانسيل مختلف: a) 25 ،b ) 50،c ) 100،d ) 150، e ) 200،f ) 300،g ) 400 ميلي ولت بر ثانيه در سطح الکترود خمير کربن اصلاح شده با نانو ذرات 2SiO . ب) تغييرات بر حسب سرعت روبش پتانسيل (نتايج از ولتاموگرامهاي چرخهاي (الف) بدست آمدهاند)47
شکل 4-7- الف) ولتاموگرامهاي پالس تفاضلي تاموکسيفن با غلظتهاي مختلف (a) 8-10 ×3 ، (b) 8-10 ×7 ،
(c) 7-10، (d) 7-10 ×3، (e) 7-10 ×5، (d) 7-10 ×7، (f) mol L-1 6-10 درمحلول بافر فسفات 5/4PH= واجدM NaCl 1/0 در سطح /CPE 2NSiO 1-s mV 100 = .? ب) نمودار تغييرات جريان دماغه آندي بر حسب غلظت تاموکسيفن49
شکل4-8- نمودار شدت جريان دماغه اکسايش تاموکسيفن سيترات بر حسب غلظت تاموکسيفن50
شکل 5-1- تصوير نموداري از مراحل تهيه زيست حسگر الکتروشيميايي i-motif DNA55
شکل 5-2- تصاوير SEM سطح (الف) CPE برهنه پس از پيشتيمار الکتروشيميايي، (ب) CPE/Cys-2NSiO، (ج) CPE/2NSiO/ i-Motif DNAو (د) CPE/Cys-2NSiO/i-Motif DNA57
شکل5-3- ولتاموگرامهاي چرخهاي محلول-4/-3 [6(CN)[Fe M 01/0 داراي M NaCl 1/0 در بافر فسفات M1/0 با 5/4 pH= در سطح (a) CPE (b) CPE/2NSiO، (c) CPE/ 2 NSiO/ i-Motif DNA و (d) CPE/ Cys- 2 NSiO/i-Motif DNA در سرعت روبش 1-s mV 50 59
شکل5-4- ولتاموگرام چرخهاي M 5-10 داروي تاموکسيفن در محلولM 1/0 بافر فسفات با 5/4 pH= داراي M 1/0 NaCl در سطحCPE (a) ، (b) CPE/ Cys- 2 NSiO، (c) CPE/Cys-2 NSiO/i-Motif DNA در سرعت روبش پتانسيل 1-s mV 5060
عنوان صفحه
شکل5-5- ولتاموگرام موج مربعي CPE/Cys- 2 NSiO/i-motif DNA، در حضور غظتهاي فزايندهايي از تاموکسيفن:(a) 8-10×7، (b) 7-10، (c) 7-10×5، (d) 7-10×7، (e) 6-10، (f) 6-10 ×5، (g) 6-10 × 7، (h) M 5-10، در محلول بافر فسفات 5/4 pH= داراي M 1/0 NaCl . الف) ضميمه ولتاموگرامهاي موج مربعي:
(c , NSiO2-Cys/CPE (b ,CPE (a CPE/Cys-2 NSiO/i-motif DNA در غياب تاموکسيفن. ب) نمودار تغييرات شدت جريان اکسايش تاموکسيفن بر حسب تغييرات غلظت آن……………………………………………………………………62
شکل5-6-الف) ولتاموگرام موج مربعي محلول تاموکسيفن با غلظت (a)M 4-10 و (b) M5-10 در بافر فسفات
5/4 pH= در سطح CPE/Cys- 2 NSiO/i-motif DNA، (c) نظير (a) و (d) نظير (b) در بافر فسفات
M1/0 با0/7 pH=63
شکل 5-6- ب) ولتاموگرام موج مربعي محلول تاموکسيفن با غلظت (a)M 4-10 و (b) M5-10 در محلول بافر فسفات M 1/0 با 5/4 pH= در سطح CPE/Cys- 2 NSiO/dsDNA، (c) نظير (a) و (d) نظير (b) در محلول بافر فسفات M 1/0 با0/7 pH= 64
شکل 5-7) طيف بيني CD محلول بافر فسفات M1/0 با a) 5/4 pH= و b) 0/7 pH= داراي µM i-motif DNA0/1…66
فهرست جدولها
عنوان صفحه
جدول3-1- موادشيميايي مورد استفاده در اين کار تحقيقاتي32
جدول4-1- نتايج حاصل از روش پيشنهادي در تعيين غلظت تاموکسيفن در نمونه پلاسما3 n=51

فهرست علائم و اختصارات
معادل فارسيمعادل انگليسيعلائم و اختصاراتولتVoltVالکترود نقره/نقره کلريد/پتاسيم کلريد(M3)Silver/silverChloride/Potassium Chloride(3M)Ag/AgCl/KCl(3M)ثانيهSecondSمولارMolarMپتانسيلPotentialEميکروآمپرMicroamperµAغلظتConcentrationCميلي ولت بر ثانيهMilivolt per secondmV s-1سرعت روبش پتانسيلPotential sweep rate?ولتامتري چرخه ايCyclic voltammetryCVالکترود خمير کربنCarbon paste electrodeCPEپتانسيل دماغهي آنديAnodic peak potentialEpaپتانسيل دماغهي کاتديCathodic peak potentialEpcميکروسکوپي الکترون روبشيScanning electron microscopySEMميلي مولارMilimolarmMميکروآمپرMicroamperµAميکروگرمMicrogram?gنانومترNanometerNmحد تشخيصLimit of detectionLODانحراف استاندارد نسبيRelative standard deviationRSDآمپرAmpereA

1-1- مقدمه
تشخيصDNA ، يکي از حوزههاي مهم بيولوژي مولکولي و مطالعات زيست فناوري است. تشخيص توالي بازهاي خاص در نوکلئيک اسيدهاي انساني، ويروسي و باکتريايي از اهميت بسزايي در حوزههاي متعدد برخوردار است که داراي کاربرد در تشخيص: عوامل بيماري، ارگانيسمهاي آلوده کننده غذايي، تحقيقات زيست محيطي و علوم جنايي ميباشد. از زمانيکه پاليکيک1، فعاليت الکتروشيميايي نوکلئيک اسيدها را کشف کرد [1]، زيست حسگرها اميدهاي تازهاي براي ايجاد روشهاي سريع، ارزان و ساده براي تشخيص نوکلئيک اسيدها فراهم ساختهاند [2]. تشخيص يا آشکارسازي الکتروشيميايي گونههاي زيستي براساس واکنشهاي الکتروشيميايي است که در طول فرآيندهاي تشخيص زيستي اتفاق ميافتد [3] .به علت اينکه واکنشهاي الکتروشيميايي مستقيماً يک علامت الکترونيکي ايجاد ميکنند، نيازي به دستگاههاي گرانقيمت تبديل علامت وجود ندارد. علاوه بر اين، به علت اينکه کاوشگر2 ميتواند براحتي بر روي الکترودها تثبيت شود، تشخيص آن ميتواند توسط آناليز الکتروشيميايي ارزانقيمت انجام شود. همچنين سيستمهاي قابل حمل براي آزمايشات کلينيکي و تحقيقات زيست محيطي توسعه يافته است [4]. ابزارهاي الکتروشيميايي، بسيار حساس، ساده و سريع بوده و براحتي به کار برده ميشوند و با فناوريهاي نانو سازگاري دارند. بنابراين به نظر ميرسد، نامزدهاي خوبي براي تشخيص سريع و ارزانقيمت بيماريهاي ژني و تشخيص گونههاي بيولوژيکي پاتوژني ميباشند.
يکي از بزرگترين چالش‌ها در قلمرو الکتروشيمي تجزيهاي، طراحي و ساخت الکترودهايي مي‌باشد که در حالت ايده‌آل بتوانند به يک گونه‌ي شيميايي خاص به صورت کاملاً گزينش‌پذير و با حساسيت بالا پاسخ دهند. زيست حسگرهاي3 الکتروشيميايي، دسته وسيعي از الکترودهاي اصلاح شده ميباشند که امروزه بسيار مورد توجه محققين قرار گرفتهاند [5]. زيست حسگر، ابزاري است که از يک لايه فعال بيولوژيکي به عنوان جزء شناساگر استفاده ميکند تا عوامل فيزيکي برهمکنش بيولوژيکي را به علامت قابل اندازهگيري تجزيهاي تبديل کند [6]. دو عامل در طراحي يک زيست حسگر مناسب نقش ايفا ميکنند: الف) روش مناسب تثبيت پذيرنده زيستي در سطح مبدل که موجب افزايش طول عمر، حساسيت و پايداري آن ميگردد. ب) انتخاب مبدل مناسب. انواع متداول مبدلهاي مورد استفاده در زيست حسگرها، شامل مبدلهاي: الکتروشيميايي [8 ،7] ، نوري (نورتابي4، جذب و رزونانس پلاسمون سطح5 ) [9]، حساس به تغيير جرم [10] و حرارت مي باشند [11]. زيست حسگرها خصوصيات و مزاياي خوبي، نظير: آساني استفاده، سرعت تشخيص مناسب، حساسيت بالا و هزينه کمتر نسبت به روشهاي طيف سنجي وکروماتوگرافي مايع با عملکرد بالا را دارا ميباشند که قادرند گونه آزمايشي مورد نظر را در غلظتهاي بسيار کم در نمونه‌هاي بيولوژيکي اندازهگيري کنند [14-12]. در حقيقت زيست حسگرها، ميتوانند با بهرهگيري از هوشمندي مواد بيولوژيك، تركيب يا تركيباتي را شناسايي نمايند که با آنها واكنش داده و بدين ترتيب يک پيام شيميايي، نوري و يا الكتريكي توليد کنند. اساس کار يک زيست حسگر تبديل پاسخ بيولوژيکي به يک پيام قابل اندازهگيري است [15]. بطور کلي هر زيست حسگر شامل، اجزاي: گونه آزمايشي مورد نظر، لايه زيستي، مبدل، پردازشگر و نمايشگر است. انواع پذيرندههاي زيستي که در زيست حسگرها مورد استفاده قرار ميگيرند، شامل: آنزيم، آنتي بادي، گيرندههاي سلولي، اسيدهاي نوکلئيک DNA6 يا RNA7، ميکروارگانيسم يا سلول کامل، بافت و غيره هستند [16].
يک زيست حسگر DNA، وسيلهاي است که عامل تشخيص بيولوژيکي آن، کاوشگر DNA است. کاوشگرهاي DNA، اليگونوکلئوتيدهاي کوتاه تک رشتهاي (ss-DNA) هستند که معمولاً کاوشگر ناميده ميشوند. دئوکسي ريبونوکلئيک اسيد (DNA)، يک مولکول رمزگذار دستورالعملهاي ژنتيکي است که در تمام موجودات زنده، شناخته شده ميباشد. درشت مولکول8DNA ، يک ساختار مارپيچي شبيه نردبان دارد که گروههاي فسفات و قند به طور يک در ميان، نردههاي نردبان و بازهاي آدنين، گوانين، سيتوزين و تيمين پلههاي آن را تشکيل ميدهند که اين بازها، دو به دو با يکديگر توانايي تشکيل پيوند هيدروژني قوي را دارند. DNA به خاطر حضورگروههاي فسفات در ساختار آن، داراي بار منفي ميباشد و از اين رو خاصيت پلي آنيوني را دارد، به طوري كه بازهاي آلي به سمت داخل و گروه فسفات به سمت بيرون يا در سطح خارجي درشت مولکول DNAقرار ميگيرند. در DNA، هر رشته از نوکلئوبازها تنها با يک نوع رشته ديگر از نوکلئوبازها جفت ميشوند که به آن جفت شدن بازهاي مکمل ميگويند. در ساختار دو رشتهايDNA ، باز آدنين در مقابل تيمين با دو پيوند هيدروژني و گوانين در مقابل سيتوزين با سه پيوند هيدروژني قرار دارد. پس يک توالي خاص از DNA قادر است تنها به توالي مکمل خود پيوند شود [17]. در سالهاي اخير، تلاشهاي زيادي براي طراحي زيست حسگرهاي الکتروشيميايي با صحت9، حساسيت10 و انتخاب پذيري11 تقويت شده، انجام شده است [18]. نانوذرات12 ميتوانند در اين زمينه بسيار مفيد باشند و در طراحي زيست حسگرهاي الکتروشيميايي که نسبت به ساير زيست حسگرها کارائي بالاتري دارند، به طور عمده اي استفاده شوند [19].
نانوذرات به عنوان يکي از مهمترين ساختارها در حوزه فناوري نانو، با توجه به اندازه کوچک آنها، خواص فيزيکي، شيميايي و الکترونيکي منحصر به فردي را نشان ميدهند که در تهيه زيست حسگرها، بسيار مورد توجه ميباشند [20]. ويژگيهاي يک ماده ميتواند به طور معني داري با اندازه ذرات آن تغيير کند. بسياري از خواص ماده، از جمله: ويژگيهاي ساختاري، گرمايي، شيميايي، مکانيکي، مغناطيسي و نوري در اثر کاهش اندازه ذره تغيير ميکند. در نتيجه، با استفاده از اين مواد در ساخت نانوزيست حسگرها، ميتوان خواص جديد و مختلفي ايجاد نمود که از آنها، بتوان براي مطالعه بهتر سيستمهاي متفاوت استفاده کرد. از ميان نانوزيست حسگرها، نانوزيست حسگرهاي الکتروشيميايي رشد خوبي داشته است ]21 [.
نانوزيست فناوري DNA، فناوري بالقوهاي است که از تلفيق زيست فناوري و فناوري نانو بوجود آمده است. نانوزيست فناوري DNA، از ساختار و خواص مولکول DNA جهت استفاده در زمينه زيستي، مهندسي و پزشکي بهره ميبرد. هدف اساسي نانوزيست فناوري DNA، ساخت مواد با ساختار تکرار شونده، وسايل و ماشينهايي در ابعاد نانو، توسعهي اين ساختارها به سطوح بزرگتر (ماکروسکوپي) با استفاده از خواص ساختاري و عملکردي و برهمکنشهاي بين مولکولي DNA است. در اين زمينه، يکي از مواردي که بسيار مورد توجه محققين قرار گرفته است، مطالعه و بررسي در مورد ساختار DNA و چگونگي عملکرد آن در شرايط محيطي متفاوت و برهمکنشهاي آن با ترکيبات مختلف بوده است [22]. همانطور که ميدانيم مولکول DNA يک ماده ژنتيکي است که حامل اطلاعات ژنتيکي در تمام موجودات زنده ميباشد. مولکول DNA، داراي توالي خاصي ناشي از چگونگي آرايش بازهاي تشکيلدهندهي آن ميباشد که اين توالي سبب ايجاد خواص خاصي در هر رشته DNA ميگردد. توالي DNA جهت پردازش اطلاعات مفيد بوده و سبب ميگردد که ساختار آن به صورت پايا و محکم درآيد. علاوه بر اين، DNA داراي خواص منحصر به فردي مانند دارا بودن ساختار هندسي در ابعاد نانو13، ذخيره و کد کردن اطلاعات14، خودتکثيري15، خودتشخيصي ساختار16 و خودآرايي17 است [23]. امروزه، محققين تعداد زيادي از نانوزيست حسگر DNA ساختهاند که از آنها در جهت مطالعه برهمکنش DNA با ساير ترکيبات از جمله: داروها، پروتئينها و ترکيبات شيميايي مختلفي استفاده شده است ]25،24[.
همچنين نانو مواد18 ، انتقال الکترون بين زيست مولکولهاي تثبيت شده و سطح الکترود را آسان ميکنند. نانوذرات براي تثبيت مولکولهاي زيستي، کاتاليز واکنشهاي الکتروشيميايي، افزايش سرعت انتقال الکترون بين سطح الکترود و پروتئين، نشان دار کردن مولکولهاي زيستي و حتي به عنوان واکنشگر عمل ميکنند [26]. با توجه به بزرگي سطح مؤثر و بالا بودن سطح انرژي، نانوذرات بيومولکولها را بشدت جذب کرده و براي تثبيت مولکولهاي زيستي در ساخت زيست حسگر بکار ميروند [28 ،27]. انواع زيادي از نانوذرات، مانند: نانوذرات اکسيدي (مثلاً 2SiO) براي ساخت حسگرهاي الکتروشيميايي و زيست حسگرها به کار گرفته شدهاند [29]. اين نانوذرات براي تثبيت مولکولهاي زيستي به دليل سازگاري خوب و آماده سازي آسان، استفاده شدهاند [31 ،30].
DNA تلومري انسان، از تکرارهاي پشت سرهم بازهاي تيمين، آدنين، گوانين و سيتوزين، CCCTAA)/(TTAGGG تشکيل شده است [32]. تلومرها داراي ساختار خاصي هستند که موجب استحکام و پايداري مولکول خطي DNA ميشوند و انتهاي كرموزوم را از تجزيه شدن، نوآرايي و الحاق انتهايي حفظ ميكنند. در هر تقسيم سلولي به شكل پيوسته، بخشي از طول تلومر كوتاه ميشود. كوتاه شدن پيوسته تلومر به جدا شدن يك سري از پروتئينها از ساختار تلومر و تغيير بيان ژن منجر ميشود. كوتاه شدن مداوم تلومر به توقف چرخه سلولي و مرگ سلولي ميانجامد [35-33]. تلومراز آنزيمي است كه بدون نياز به الگو، موجب سنتز تلومر ميشود. اين سلولها به كمك آنزيم تلومراز، كوتاه شدن تلومر را كه در پي تقسيمهاي متوالي روي ميدهد، جبران ميکنند [36]. با اين حال، آنزيم تلومراز، در حدود 90 درصد از سلولهاي سرطاني، سطح بالايي از فعاليت را دارد و همين فعاليت بالا منجر به ايجاد سرطان ميگردد [38 ،37]. چنانچه اتصال تلومرازها به نواحي تلومري توسط برهمکنش مولکولهاي کوچک با نواحي تلومري مهار شود، به شکل مستقيم فعاليت تلومراز کاهش مييابد.
از طرف ديگر، در رشتههاي DNAي غني از باز سيتوزين C، ساختارهايي مي تواند شکل بگيرد که در آن، هر C از طريق پيوند هيدروژني با سه C ديگر در ارتباط باشد، به شرط آنکه Cي مقابل آن به صورت همي پروتونه باشد، يعني جفت باز C-C+ شکل بگيرد، به چنين ساختاري، ساختار i-motif ميگويند و در شرايطي تشکيل ميشود که رشته DNA غني از باز سيتوزين باشد [40 ،39]. ترکيباتي که با تواليهاي ذکر شده بر همکنش بدهند، قادر به مهارکردن فعاليت تلومراز ميباشند. پايداري ساختارi-motif به تکرار توالي داراي سيتوزين، pH اسيدي ملايم، ماهيت و غلظت کاتيونهاي موجود در محلول بستگي دارد. پايداري ساختار i-motif پيچ خورده در pH اسيدي ملايم، يک استراتژي خوب براي درمان سرطان است، چون مي
تواند از واکنش تلومراز در سلول سرطاني جلوگيري ميکند [41].
تاموكسيفن‌ يك‌ داروي‌ ضد سرطان‌ است‌ كه‌ براي‌ درمان‌ سرطان‌ پستان‌ تجويز مي‌شود. در مواردي‌ كه‌ سرطان‌ به‌ ساير نقاط‌ بدن‌ پخش‌ شده‌ باشد، نيز استفاده‌ مي‌شود. اين‌ دارو به‌ ويژه‌ بر روي‌ سرطانهايي‌ كه‌ با استرژون‌ تحريك‌ مي‌شوند، مؤثر مي‌باشد. استروژن رشد سلول‌هاي سرطاني پستان را بالا مي‌برد. بعضي از سرطان‌هاي پستان را در دستة گيرندة مثبت استروژن (حساس به هورمون) طبقهبندي مي‌كنند، بدين معنا که سلول‌هاي سرطاني پروتئيني دارند که استروژن به آن وابسته است. رشد اين سلول‌هاي سرطاني به استروژن وابسته است. از آنجا كه تاموکسيفن برخلاف تأثير استروژن بر اين سلول‌ها عمل مي‌کند، گاهي به آن ضد استروژن نيز ميگويند. تاموکسيفن فقط در درمان گيرندة مثبت استروژن سرطان پستان مؤثر است. بنابراين، بايد پيش از تصميم‌گيري در مورد گزينه‌هاي درماني، وضعيت گيرنده‌هاي هورمون تومور را جهت درمان سرطان پستان تعيين كرد. تاموکسيفن سيترات (غير استروئيدي ضد استروژن) مهمترين عامل هورموني در درمان سرطان سينه براي بيش از دو دهه شناخته شده که ميتواند حدود 50 درصد زناني که در خطر ابتلا به سرطان سينه هستند را درمان کند. اين دارو با اتصال به گيرندههاي سيتوپلاسمي (گيرنده
هاي استروژن)، تقسيم سلولي را مهار کرده و در فعاليت استروژن، که هورموني زنانه است، مداخله ميکند. استروژن احتمال پيشرفت سرطان را در پستان بالا ميبرد. تاموکسيفن سيترات دارويي است که به صورت قرص خوراکي عرضه ميشود [44-42].
در اين کار، سعي ميشود با طراحي زيست حسگرهايي بر مبناي ساختار i-motif، برهمکنش اين ساختار با داروي ضد سرطان تاموکسيفن سيترات19، مورد بررسي قرار گيرد. به دليل اهميت داروي تاموکسيفن سيترات در درمان سرطان سينه، چندين روش براي اندازهگيري اين دارو ارائه شده که شامل الکتروفورز موئينه، کروماتوگرافي مايع با عملکرد بالا و طيف سنجي ميباشد [45]، اما روشهاي ذکر شده، پيچيده و پر هزينهاند. روشهاي الکتروشيميايي نسبت به روشهاي ديگر، به دليل: سادگي، حساسيت مطلوب، قابليت انطباق با فناوريهاي جديد، امکان کوچکسازي سيستم و هزينه پايين، بسيار مورد توجه قرار گرفتهاند [46].
با استفاده از طيف بيني دورنگ نمايي دوراني (CD)20، ميتوان اطلاعاتي را در مورد ساختار تشکيل شده و حالت قرار گرفتن رشتههاي DNA براي تشکيل ساختار i-motif بدست آورد. ويژگي ممتاز i-motif با طيف بيني دو رنگ نمايي دوراني تعيين ميشود. معمولا” در طيف CD براي ساختار i-motif يک دماغه مثبت نزديک 280 نانومتر و يک دماغه منفي در 260 نانومتر مشاهده ميشود [47].
يک الکترود کار21 مناسب، نقش عمدهاي در توسعهي زيست حسگر الکتروشيميايي دارد. از ميان الکترودهاي کار مختلف، الکترودهاي خمير کربن (CPE)22 معمولترند زيرا خمير کربن به راحتي و با هزينه کم تهيه مي
شود و براي تهيه الکترودهاي اصلاح شده با ترکيبات ديگر نيز بسيار مناسب هستند [48].
ازاينرو، در بخش اول اين کار، يک زيست حسگر الکتروشيميايي DNA با استفاده از الکترود خمير کربن برهنه و خمير کربن اصلاح شده با نانوذرات 2SiO تهيه شد. نانوذرات 2SiO ميتواند سبب افزايش رسانايي سطح الکترود خميرکربن شده و موجب بهبود علامت تجزيهاي الکترود اصلاح شده گردد. نانوذرات 2SiO، سبب افزايش حساسيت زيست حسگر DNA شده و دستيابي به حد تشخيصهاي پايينتر نسبت به الکترود خمير کربن برهنه را فراهم خواهد کرد. به دليل اهميت ساختار i-motif -DNAدر سلولهاي بدن انسان و اهميت زياد اين ساختار در بلوکه کردن انتهاي تلومرها و مهار آنزيم تلومراز و همچنين بيماريهاي ناشي از سرطاني شدن سلولها، مطالعه اين نوع ساختارهاي DNA و پايدار کردن آنها در اثر ايجاد پيوند با داروي تاموکسيفن به عنوان ليگاند مورد توجه قرار ميگيرد. براي بررسي رفتار تاموکسيفن سيترات در پايدار کردن اين ساختار، از فنون مختلف الکتروشيميايي، نظير: ولتامتري پالس تفاضلي، ولتامتري چرخهاي استفاده شده و رفتار الکتروشيميايي زيست حسگر تهيه شده قبل و بعد از مرحله تثبيت و برهمکنش با داروي مورد نظر بررسي ميگردد. همچنين از روش طيف بيني دورنگ نمايي دوراني يا CD براي بدست آوردن اطلاعاتي در مورد نحوه برهمکنش اين دارو با ساختار i-motif-DNA و نحوه شکلگيري ساختار مورد نظر استفاده ميگردد. همچنين امکان اندازهگيري الکتروشيميايي داروي تاموکسيفن سيترات در سطح الکترود خمير کربن اصلاح نشده و اصلاح شده با ذرات 2SiO به کمک ولتامتري پالس تفاضلي و ولتامتري چرخهاي مورد مطالعه قرار ميگيرد.
2-1- الکترودهاي اصلاح شده شيميايي
اصلاح سطح الکترودها به منظور فراهم کردن برخي کنترلها روي چگونگي برهم کنش سطح الکترود با محيط پيرامون، يکي از پرکاربردترين بخش تحقيقاتي در الکتروشيمي طي چند دهه گذشته است [48]. ويژگيها و عملکرد مختلف اين الکترودها عبارتند از: الکتروکاتاليز واکنشها [50 ،49]، آشکارسازي تغييرات در اثر انجام واکنشهاي الکتروشيميايي، جلوگيري از پديدهي خوردگي، مفيد براي توصيف فرايندهاي انتقال الکترون و جرم در پليمرها و ديگر مواد و آگاهي از اينکه چگونه واکنشها و فرايندها در ساختارهاي سطحي اتفاق ميافتد [51].
يک الکترود اصلاح شده شيميايي بر اثر پوشاندن سنجيده سطح يک الکترود با لايه نازکي از يک ماده شيميايي انتخابي به منظور تغيير و تعديل برخي از ويژگيهاي آن الکترود از قبيل خواص شيميايي، نوري، الکترونيکي و انتقال بار بدست ميآيد [52]. هر الکترود اصلاح شدهي شيميايي از دو قسمت بستر يا الکترود زمينه و اصلاحگر تشکيل ميشود.
الکترود زمينهاي که بهکار گرفته ميشود خود بايد چندين ويژگي منحصر به فردي داشته باشد تا براي مدتهاي طولاني، بتوان از آن، استفاده کرد:
الف- بايد هدايت الکتريکي بالايي داشته باشد.
ب- در برابر خوردگي و صدمات شيميايي ناشي از محلول الکتروليت، مقاومت خوبي داشته باشد.
ج- در پتانسيلهاي خيلي مثبت و تحت دماهاي بالا و شرايط اسيدي شديد، براي زمانيکه الکترود به عنوان آند بهکار گرفته ميشود، پايدار باشد.
د- همچنين از پايداري مکانيکي بالايي برخوردار باشد.
انواع الکترودهاي زمينهاي که بهکار گرفته ميشوند، عبارتند از: مواد کربني، شامل: خمير کربن، گرافيت، کربن شيشهاي، نانو لولههاي کربني و الکترودهاي شبکه چاپي که بطور گستردهاي در تحقيقات مبتني بر نوکلئيک اسيدها و تشخيص الکتروشيميايي آنها به علت مزاياي متعدد اين نوع الکترودها مورد استفاده قرار گرفتهاند [55-53]. همچنين، فلزات متعدد يا اکسيدهاي فلزي، نظير: طلا [56]، پلاتين [57]، نقره [58]، نيمرساناها در اين زمينه نيز بکار رفتهاند.
لايههاي اصلاحگر مورد استفاده براي اصلاح شيميايي الکترودها ميتواند از مواد مختلفي، از قبيل: سورفاکتانتها، گونههاي معدني جذب سطحي شده، نانوذرات فلزي يا شبه فلزي، نانو لولههاي كربني، ترکيبات آلي- فلزي و مواد بيولوژيکي تشکيل شده باشد [59]. اصلاح شيميايي سطح الکترودها، يک مسير قدرتمند براي تنظيم عملکرد آنها فراهم ميکند. اين اصلاح سطح، زمينههاي تحقيقاتي جديدي در الکتروشيمي تجزيهاي باز ميکند که موجب افزايش گزينش پذيري، پيش تغليظ ترکيبات خاص، بهبود خواص الکتروکاتاليزي و يا کاهش تداخل در نمونههاي پيچيده، مثل نمونههاي زيستي ميشود [60]. مساحت سطحي زياد، عاملي کليدي در کارکرد نانوذرات به عنوان کاتاليزوها در ساختارهاي الکترودهاي اصلاح شدهي شيميايي ميباشد [61]. به عنوان مثال، با استفاده از اين خاصيت ميتوان کارآيي کاتاليزورهاي شيميايي را به نحو مؤثري بهبود بخشيد و يا در توليد چندسازهها23 با استفاده از اين ذرات، پيوندهاي شيميايي مستحکمتري بين ماده زمينه و ذرات برقرار نموده و استحکام آنها را به شدت افزايش داد. علاوه براين، افزايش سطح ذرات، فشار سطحي را کاهش داده و منجر به تغيير فاصله بين ذرات يا فاصله بين اتمهاي ذرات ميشود. تغيير در فاصله بين اتمهاي ذرات و نسبت سطح به حجم بالا در نانوذرات، تأثير متقابلي در خواص ماده دارد. حسگرها و زيست حسگرها، نيز از انواع ديگر الكترودهاي اصلاح شده به روش شيميايي ميباشند كه به منظور اندازه گيري گونههاي شيميايي يا زيستي ارزشمند با كمترين تداخل، به صورت انتخابي در حضور ساير گونهها طراحي و ساخته ميشوند.
2-2- حسگرها
امروزه، نياز روز افزون به تشخيص و اندازه‌گيري عناصر و ترکيبات شيميايي در بخش‌هاي مختلف محيط اطراف، اعم از زنده يا غير زنده، ديده مي‌شود. اين نياز مي‌تواند با مواردي چون جلوگيري از آلودگي محيط زيست، افزايش سلامتي و ايمني فردي افزايش يابد. تشخيص و اندازهگيري مواد شيميايي موجود در جو و محيط زندگي، آلودگي آب‌ها، گازهاي قابل اشتعال در صنايع مختلف، كنترل سوخت‌ها، تعيين و تشخيص گونه‌هاي شيميايي در سيالات، محيط‌هاي زنده و به‌خصوص بدن انسان، نياز به كار بر روي حسگرها24 و زيست حسگرها25 را بيان مي‌كنند. در اين زمينه، مطالعه و تحقيق در مورد طول عمر حسگرها، پايداري فيزيكي و شيميايي و قابليت كاربرد آن‌ها در محيط‌هاي مختلف داراي اهميت خاصي مي‌باشد. تعيين آلايندههاي محيطي و گونه‌هاي مورد نظر در مقادير اندک، بدست آوردن حدود آشکارسازي پايين‌تر و بهبود در دقّت و صحت اندازه‌گيري‌ها از اهداف شيمي تجزيه نوين است. ساخت ابزاري که قابل حمل و کوچک بوده و داراي حساسيت بالا براي اندازه‌گيري گونههاي شيميايي مورد نظر باشد، از اهداف شيميدانهاي تجزيه است.
به‌ طور کلي حسگرها را مي‌توان به عنوان ابزارهايي که يک کميّت فيزيکي و يا شيميايي مرتبط با گونه شيميايي مورد نظر را به علايم قابل آشکارسازي تبديل مي‌کنند، تعريف کرد. حسگرها بسته به گونه شيميايي مورد نظر، انواع متفاوتي دارند که از ميان آن‌ها، حسگرهاي الکتروشيميايي و زيست حسگرهاي الکتروشيميايي داراي اهمّيت خاصي هستند [62].
2-3- حسگرهاي الکتروشيميايي
حسگرهاي الکتروشيميايي، زير شاخهي مهمي از حسگرهاي شيميايي ميباشد که در آنها، الکترود به عنوان عنصر انتقال دهنده علائم، مورد استفاده قرار ميگيرد [63]. حسگرهاي الکتروشيميايي در مقايسه با ساير حسگرهاي شيميايي به خاطر خواصي، نظير سهولت آزمايش، قيمت کم و قابليت شناسايي فوق العاده، بسيار مورد توجه هستند و در حوزههاي کشاورزي، باليني، زيست محيطي و صنعتي کاربرد وسيعي يافتهاند [64]. يک حسگر الکتروشيميايي نوعي، شامل: يک الکترود حسگر26 (الکترود کار) و يک الکترود مخالف27 است که به‌وسيله لايه نازکي از الکتروليت از يکديگر جدا شده‌اند (شکل 2-1). به ‌طور کلّي، حسگرهاي الکتروشيميايي از طريق واکنش اکسايش-کاهش گونه مورد نظر روي سطح الکترود و توليد علامت الکتريکي متناسب با غلظت آن عمل مي‌کنند. گونه مورد نظر، پس از آنکه از يک منفذ ورودي موئينه، داخل حسگر شد، از يک سد آب گريز28 عبور کرده و نهايتا به سطح الکترود مي‌رسد. اين امر باعث مي‌شود که گونه مورد نظر در سطح الکترود کار، طي مکانيسم اکسايش-کاهش، وارد واکنش شده و يک علامت الکتريکي توليد کند که با غلظت گونه مورد نظر متناسب باشد. به ‌وسيله يک مقاومت خارجي که الکترودها را به هم متصل مي‌کند، جرياني متناسب با غلظت گونه مورد نظر بين الکترودهاي کار و مخالف جاري ميشود. اين جريان مي‌تواند به منظور تعيين غلظت گونه آزمايشي مورد نظر مورد استفاده قرار گيرد. در حسگري که براي کار به يک ولتاژ خارجي نياز دارد، داشتن پتانسيلي ثابت و پايدار در الکترود حسگر، از اهميت زيادي برخوردار است. از نظر تاريخي، قديمي‌ترين حسگر الکتروشيميايي به دهه 1950 بر مي‌گردد و به حسگرهاي گازي مربوط مي‌شود که بر روي اندازه‌گيري‌هاي اکسيژن موجود در هوا استفاده مي‌شدند [65]. پس از آن و در اواسط دهه 1980، حسگرهاي الکتروشيميايي در ابعاد بسيار کوچک جهت شناسايي و اندازه‌گيري گازهاي سمّي مختلف با حساسيت و گزينش‌پذيري بالا طراحي شدند [66].
حسگرهاي الکتروشيميايي را براساس نوع علامت تجزيهاي ايجاد شده، به سه دسته اصلي: حسگرهاي پتانسيل سنجي، آمپرسنجي و هدايت سنجي تقسيم ميکنند [67]. در نهايت، علامت الکتريکي توليد شده در اثر انجام واکنش‌هاي اکسايش-کاهش روي سطح الکترود کار اندازهگيري ميشود که متناسب با غلظت گونه مورد نظر است. ميزان ولتاژ مورد نياز جهت اعمال به الکترود کار هر حسگر آن را براي گونه آزمايشي مورد نظر گزينش‌پذير مي‌کند.
شکل 2-1- ساختار يک حسگر الکتروشيميايي نوعي [68].
2-4- زيست حسگرها
حسگرهاي الكتروشيمياييDNA ، توان تجزيهاي روشهاي الكتروشيميايي را با خصوصيات فرآيند تشخيص اسيد نوكلئيك تلفيق کرده و اميدهاي زيادي را



قیمت: تومان


پاسخ دهید